На протяжении более 20 лет морская биолог Мэри Хагедорн сталкивалась с, казалось бы, неразрешимой проблемой. Она искала способ заморозить и разморозить эмбрионы рыбок данио.
Важные экспериментальные животные, гены рыбок данио, настолько близки к генам человека, что их использовали для изучения таких заболеваний, как мышечная дистрофия и меланома. Если бы репродуктивный материал можно было легко заморозить и разморозить, эти исследования было бы легче проводить и тиражировать, поскольку исследователям не пришлось бы обходить графики нереста или бороться с генетическим дрейфом.
Проблема заключается в том, как рыба размножается. Ученые успешно замораживают - или используют криоконсервацию, если использовать технический термин - и размораживают жизнеспособные сперматозоиды и яйца многих животных на протяжении десятилетий. Но рыбьи яйца развиваются вне тела родителя, что создает физиологические проблемы, которые не возникают, когда вы работаете с клетками крупного рогатого скота или даже людей. Яйцо содержит питательные вещества, в которых нуждается развивающийся эмбрион, а также имеет собственную броню, что означает, что эти яйца большие и часто заключены в относительно непроницаемую мембрану.
Проще говоря, рыбные яйца имеют тенденцию быть слишком большими, чтобы быстро замерзнуть или разморозиться при обычных обстоятельствах. Хагедорн, который работает биологом-исследователем в Центре выживания видов при Национальном зоопарке и Институте охраны природы при Смитсоновском институте, сравнивает их с планетами. Яйца млекопитающих, как правило, больше похожи на мельчайших членов нашей солнечной системы, скажем, Меркурий. Яйцо данио ближе к гиганту, подобному Юпитеру.
«Если вы не замораживаете ткань должным образом, в ней образуются ледяные кристаллы, которые проникают в клетки и разрушают их», - говорит Хагедорн.
Она провела 12 лет в поисках обходного пути, в конечном итоге остановившись на новом решении, которое включало микроинъекцию «криопротектора» (в основном, антифриза) в яйца, метод, позволяющий этому агенту обходить защитную мембрану. Правильно откалиброванные, чтобы избежать отравления клеток, эти защитные средства могут помочь обеспечить равномерное остекловывание яйца (становящегося стеклообразным), когда его окунают в ванну с жидким азотом.
«Если вы не замораживаете ткань должным образом, в ней образуются ледяные кристаллы, которые проникают в клетки и разрушают их», - говорит Мэри Хагедорн о проблеме, с которой она столкнулась, пытаясь заморозить эмбрионы рыбок данио. (Энциклопедия жизни / биоизображения) В то время как этот процесс мог эффективно привести эмбрионы рыб в состояние приостановленной анимации, нагрев их снова оставался проблемой. Когда они нагреваются, существует промежуточная точка между идеальным стеклоподобным состоянием и комнатной температурой, когда кристаллы льда могут снова начать образовываться. И эти кристаллы могут повредить клеточный материал, что делает его неспособным к дальнейшему развитию.
«Нам нужно было разморозить их намного быстрее», - сказал Хагедорн. «Используя инструменты, которые у нас были в 2011 году., , Я ударил стену.
Некоторое время она сдалась.
И именно так все могло бы остаться, если бы не случайная встреча на конференции по криоконсервации где-то в 2013 году, где она услышала выступление Джона Бишофа, профессора машиностроения в Университете Миннесоты.
Как говорит Бишоф, он выступал на не связанную тему, касающуюся наночастиц оксида железа, которую его лаборатория использовала для безопасного согревания тканей человека для трансплантации. Его исследование вызвало реакцию Хагедорна, побудив ее задуматься о ее возможностях для применения не для млекопитающих.
«Она сказала: что вы можете сделать, чтобы помочь мне с эмбрионами», - вспоминает Бишоф.
Этот первоначальный вопрос породил сложное, продолжающееся междисциплинарное сотрудничество, в котором Хагедорн и Бишоф настаивают на важности работы другого.
Их результаты, опубликованные на этой неделе в журнале ACS Nano, показывают, что в конце концов можно было бы безопасно безопасно разогреть замерзшие эмбрионы рыб.
Вдохновением для их работы послужили усилия ныне покойного ученого по имени Питер Мазур, который подумал, что возможно согреть замороженные эмбрионы лазерами. (Да, лазеры.) Несмотря на то, что идея была потенциально обоснована, Хагедорн сказал мне, что найти лазеры для передачи тепла биологическому материалу сложно. Вместе с другим исследователем по имени Фриц Кляйнханс, однако, Мазур выяснил, что, возможно, можно ввести другое вещество в раствор с зародышем, которое будет поглощать тепло от лазера и переносить его в биологическое вещество.
В случае с Мазуром это означало технический углерод в форме индийских чернил, вещество, которое хорошо поглощает и передает тепло - и то, что, по словам Кляйнханса, вы можете просто купить на Amazon.com. Например, если его поместить вокруг замороженного эмбриона мыши, один лазерный импульс может почти мгновенно довести клеточный материал до комнатной температуры, минуя промежуточную фазу потепления, когда грозят образование кристаллов льда. Кляйнханс говорит, что на более ранней стадии работы Хагедорна она надеялась, что этот метод может работать и для эмбрионов рыбок данио. Увы, они были все еще слишком велики, и к тому времени, когда внешнее тепло добралось до центра, уже образовались смертельные ледяные кристаллы.
Как Хагедорн, Бишоф и их сотрудники пишут в своей новой статье, однако, был другой путь. Распространение индийских чернил на внешней стороне эмбриона, возможно, было недостаточно, но что, если они вставили какой-нибудь другой отзывчивый материал перед замораживанием? Для этого они поселились на золотых наностержнях - крошечных молекулярных структурах, на порядок меньших человеческого волоса - которые они микроинъецировали вместе с антифризными агентами в эмбрион до сохранения, используя методы, разработанные Хагедорном много лет назад.
Как пишут исследователи в своей статье: «Эти наночастицы могут эффективно генерировать тепло, когда длина волны лазера совпадает с энергией поверхностного плазмонного резонанса золотых наночастиц». Это сложный способ сказать, что наностержни могут поглощать и усиливать энергию от короткой вспышки света.
Золото, как и многие другие вещества, проявляет другие свойства на наноуровне, чем в массе. Хорошо откалиброванный миллисекундный лазерный импульс может внезапно нагреть зародыш за счет распределяемого по нему золота, нагревая его с удивительной скоростью 1, 4 х 10 7 ° С в минуту, почти непостижимой температурой, которая может быть достигнута при быстрых всплесках, которые исследователи нанимают.
«За один миллисекундный импульс лазера вы переходите от жидкого азота к комнатной температуре», - говорит Бишоф. Примечательно, что в отличие от любого метода, который Хагедорн пытался применить ранее, результаты были достаточно горячими и достаточно широко распространенными, чтобы успешно разогревать весь эмбрион рыбок данио.
Когда этот барьер наконец преодолен, вопросы остались. Ключевым среди них было то, будут ли эти эмбрионы все еще жизнеспособными. Как сообщают исследователи в своей статье, значительную часть составили, хотя и не все. Из тех, которые они разморозили, 31% сделали это только через час после потепления, 17% пересекли трехчасовую отметку, и только 10% все еще развивались после 24-часовой отметки.
Хотя это может показаться небольшим, это намного больше, чем выживаемость с нулевым процентом, которую дали более ранние методы. Хагедорн надеется, что будущая работа еще больше «увеличит» эти цифры. И она остается уверенной даже в 10-процентной цифре. «Рыба может производить миллионы яиц, и если бы я успешно заморозил 10 процентов из них, это действительно хорошее число», - говорит она.
Конечно, борьба с миллионами яиц потребует от них дальнейшего преобразования процесса для повышения эффективности. На этом этапе большая часть этой работы ложится на плечи Бишофа и других в его лаборатории, где уже ведется работа по повышению «пропускной способности» процесса, что потенциально может превратить его в более промышленное предприятие. «Я думаю, что в ближайшие годы к этому будет добавлен ряд стимулирующих технологий», - сказал он мне.
Если эта работа будет успешной, Хагедорн думает, что у нее могут быть другие виды использования, выходящие далеко за рамки скромных рыбок данио.
«Многие фермеры аквакультуры хотят заморозить рыбу [репродуктивный материал], потому что они нерестятся только один раз в год», - сказала она. «У вас есть этот аспект бума и спада в управлении их фермами. Если бы вы могли вынимать эмбрионы из морозильника более запланированным образом, это сделало бы еду дешевле и надежнее ».
Это также может оказать влияние на сохранение дикой природы. Хагедорн, который сегодня работает в основном над кораллами, считает, что это может помочь нам восстановить поврежденные рифы. Она также предполагает, что это может в конечном итоге восстановить истощенные популяции лягушек и, возможно, спасти и другие виды. Независимо от того, куда эта работа приведет нас в будущем, она является свидетельством потенциала научного сотрудничества сегодня.
«Сначала это, честно говоря, не казалось реальным. Это имеет биологический смысл, что мы могли бы сделать это, но казалось, что мы никогда не соберем все части вместе », - сказала она мне. «Если бы я не сел рядом с Джоном на том собрании, мы бы никогда этого не сделали. Без наших совместных усилий - техники и биологии - этого бы не случилось ».
